P1 mouse를 이용한 Spheroid culture 관련 질문 드립니다. (3D cell culture 관련)

안녕하세요.


분야를 옮기고 처음으로 실험 전 과정을 직접 설계하고 있는 석사과정생입니다.
문헌으로는 답이 나오지 않는 부분들이 있어, 실무자 분들의 경험을 여쭙고자 글을 올립니다.


큰 틀은 다음과 같습니다. P1 C57BL/6 피질을 해리해 ULA 96-well plate에서 cortical spheroid를 만들고, AAV로 ChR2를 발현시킨 뒤 whole-cell patch와 LFP로 광유발 반응을 보는 설계입니다.


1) ULA 무원심 응집
레퍼런스를 통해 ULA + 자발 침강으로 정했습니다. Ko et al(2021)의 ULA 위상차 시간 경과를 참고하였을 때, DIV1에는 작은 응집체가 표면에 흩어져 있고 DIV3에 중앙에 단일 구체가 생김을 확인하였습니다. 그래서 응집 판정을 DIV3로 미뤄 잡았습니다.
설치류 일차 피질세포를 ULA에서 무원심으로 응집시키는 것이 맞는지, 그리고 DIV3까지 기다리면 대체로 단일 구체가 되는지 모르겠습니다. 무원심일 때 응집 실패(한 well에 여러 덩어리로 남는) 비율이 체감상 어느 정도였는지 궁금합니다.


2) 파종 밀도와 직경 — rat 값을 mouse에 그대로 쓸 수 있는지
rat 쪽 실측(ULA 96-well, 12,000–13,000 cells/well → 약 500 µm)은 찾았는데 mouse 실측이 거의 없습니다. 8,000 cells/well을 중심으로 2,000 / 4,000 / 8,000 / 16,000을 병렬 비교할 생각입니다.
mouse에서 같은 파종 수로 rat보다 작게 나오나요? 체감 차이가 있으셨는지 궁금합니다. 목표 직경을 300–400 µm로 잡았는데, 이 크기에서 중심부 괴사가 실제로 문제가 되는지, 그리고 전기생리 분석을 수행할 때 문제가 되지 않았는지도 혹시 알려주실 수 있는지 여쭙습니다.


3) Papain 과분해를 해리 당일에 알아볼 수 있는지
랩의 2D 조건이 37 °C에서 25분인데, mouse spheroid에는 길 수 있다고 판단해 5 / 10 / 25분 세 조건을 병렬 비교할 예정입니다.
과분해된 조직을 해리 당일에 알아보는 징후가 있을까요? trypan blue 생존율 외에 보시는 지표(덩어리 상태, 상층액 점도, 세포 크기 분포 등)가 있는지 궁금합니다. 지금은 응집 성공률로 판정하려고 DIV3까지 기다릴 계획인데, 당일에 가늠할 수 있으면 같은 litter로 재시도가 가능해서 여쭙습니다.


바쁘신 와중에도 긴 글 읽어주셔서 감사합니다.